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首頁(yè)-技術(shù)文章-利用微波快速高效水解寵物食品中的氨基酸

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利用微波快速高效水解寵物食品中的氨基酸

更新時(shí)間:2022-11-10       點(diǎn)擊次數(shù):1919

 

介紹

 

蛋白質(zhì)在濕寵物食品和干寵物食品的生產(chǎn)過(guò)程中起著重要作用。蛋白質(zhì)的質(zhì)量和數(shù)量不僅影響生產(chǎn)的總成本,還影響消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品的興趣。評(píng)估膳食蛋白質(zhì)質(zhì)量的一種方法是通過(guò)氨基酸水解檢查樣品的總氨基酸含量。通常,蛋白質(zhì)在酸性或堿性條件下水解24小時(shí)以上。這種處理打破了蛋白質(zhì)中氨基酸殘基之間的肽鍵,終實(shí)現(xiàn)了每個(gè)氨基酸的鑒定和定量。由于常規(guī)加熱的特點(diǎn)是緩慢的體積加熱、不穩(wěn)定的熱梯度和不一致的反應(yīng)產(chǎn)率,因此需要較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間。
微波輔助反應(yīng)已被強(qiáng)調(diào)為一種顯著縮短水解時(shí)間、提高反應(yīng)產(chǎn)率和重現(xiàn)性的方法。1,2 CEMDiscover®2.0微波反應(yīng)器為優(yōu)化蛋白質(zhì)水解反應(yīng)提供了一條級(jí)好的途徑。在此,對(duì)濕和干寵物食品進(jìn)行傳統(tǒng)的酸水解以及優(yōu)化的微波輔助水解條件。使用Waters AccQ Tag™ 超衍生試劑盒,通過(guò)柱前衍生法測(cè)定每個(gè)樣品的氨基酸含量,然后在260nm下進(jìn)行LC-PDA分析。總的來(lái)說(shuō),Discover 2.0的結(jié)果較優(yōu)于傳統(tǒng)水解,且具有關(guān)鍵的優(yōu)點(diǎn),包括更短的反應(yīng)時(shí)間、更清潔的水解產(chǎn)物和更快的分析時(shí)間。
 
材料和方法
 
試劑和樣品
化學(xué)品從商業(yè)供應(yīng)商處購(gòu)買(mǎi),未經(jīng)進(jìn)一步純化即可使用。用于傳統(tǒng)和微波輔助氨基酸水解的溶液在使用前新鮮制備。所有玻璃器皿在110°C的空氣烘箱中干燥4小時(shí)。所有寵物食品樣品均化并儲(chǔ)存在陰涼干燥的地方(對(duì)于干樣品)或4ºC(對(duì)于濕樣品),直到分析。使用分析天平將每個(gè)樣品的4050mg部分稱(chēng)重到其反應(yīng)容器中。使用Waters AccQ Tag Ultra Derivation試劑盒分析所有樣品,用于260nm下的LC-PDA分析。
 
傳統(tǒng)酸水解法
將寵物食品樣品加入清潔干燥的10 mL玻璃瓶中,然后加入2mL 6 N HCl。然后用N2吹掃小瓶,快速密封,然后放入110°C 空氣烘箱中24小時(shí)。將樣品水解物冷卻至室溫,然后通過(guò)0.2 µm PTFE過(guò)濾器。然后用6M NaOH中和無(wú)顆粒樣品,以準(zhǔn)備AccQ Tag衍生化。
 
Discover 2.0 水解方法
水解反應(yīng)制備:將各樣品的50 mg部分添加到配備有微攪拌棒的35mL Pyrex容器中。用移液管將5mL體積的含1%苯酚(w/v)的6N HCl移到每個(gè)容器中。用N2流吹掃容器5分鐘,用Tefon內(nèi)襯硅帽快速密封,并放置在自動(dòng)取樣器架中,以便自動(dòng)放置到Discover 2.0中。反應(yīng)完成后,將冷卻的樣品中和并過(guò)濾,以準(zhǔn)備AccQ Tag™ 生化。
方法編程:在Discover 2.0系統(tǒng)中編程一步動(dòng)態(tài)法,用于寵物食品樣品的氨基酸水解。
 
酸水解
容器類(lèi)型:Pyrex
控制類(lèi)型:動(dòng)態(tài)
溫度:160°C
時(shí)間:30分鐘
壓力:300 PSI
功率:300 W
攪拌:高
 
分析樣品制備
對(duì)于AccQ Tag衍生化,將來(lái)自Waters AccQ Tag-Ultra衍生化試劑盒的70µL硼酸鹽緩沖液添加到完整的回收小瓶中,然后添加10µL過(guò)濾和中和的樣品。將小瓶蓋上并使用旋渦混合器混合。此外,將20µLWaters試劑盒制備的衍生化試劑添加到每個(gè)樣品反應(yīng)中,移液管jian端直接置于反應(yīng)溶液中。在分析之前,將總反應(yīng)渦旋10秒,然后在55℃下加熱10分鐘。
 
分析
4µL每種衍生反應(yīng)注入ACQUITY™上變頻器系統(tǒng),連接到Waters PDA探測(cè)器。在Waters AccQ Tag Ultra C18柱(1.7µm2.1 x 100 mm)上以0.4 mL/min的流速進(jìn)行分離。柱溫為55℃。洗脫梯度如表1所示。流動(dòng)相為A:Waters AccQ Tag洗脫A,在MilliQ水中稀釋10倍,B:Waters-AccQ Tag-Eluent B。為了測(cè)定每種氨基酸的氨基酸濃度,將Waters氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品Waters Corporation,零件號(hào)WAT088122)衍生為以下濃度15102550100 pmol/µL,并且所得到的線性曲線被強(qiáng)制通過(guò)零。所有分析均使用Waters TargetLynx軟件進(jìn)行
 
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表1. 用于衍生氨基酸分離的梯度
 
結(jié)果和討論
使用CEMDiscover 2.0微波反應(yīng)系統(tǒng)對(duì)干狗(貓)糧和濕寵物食品樣品進(jìn)行微波輔助氨基酸水解。每種水解產(chǎn)物的氨基酸含量通過(guò)柱前衍生化測(cè)定,隨后通過(guò)配備PDA檢測(cè)器的LC分析測(cè)定,PDA檢測(cè)器設(shè)置為在260nm下監(jiān)測(cè)。將結(jié)果與從相同樣品的傳統(tǒng)烘箱水解反應(yīng)獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。傳統(tǒng)的結(jié)果被認(rèn)為是*的回收率。2描述了每個(gè)氨基酸殘基與其傳統(tǒng)水解對(duì)應(yīng)物的回收率。對(duì)于干和濕寵物食品樣品,所有回收率均在可接受的回收率范圍內(nèi),60130%。此外,與傳統(tǒng)水解反應(yīng)相比,微波輔助反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差更高(如1所示)。
與傳統(tǒng)水解反應(yīng)相比,微波輔助反應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)偏差方面表現(xiàn)出更高的精度(如1所示)。
Discover 2.0與傳統(tǒng)氨基酸水解協(xié)議相比具有多種優(yōu)勢(shì)。添加磁攪拌有助于樣品的均勻性,而壓縮空氣冷卻使反應(yīng)容器在幾分鐘內(nèi)達(dá)到安全的處理溫度。Discover 2.0的微波加熱機(jī)制提供了與傳統(tǒng)加熱相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果,在30分鐘內(nèi)提高了精度,從而縮短了分析時(shí)間,并為反應(yīng)優(yōu)化提供了更大的機(jī)會(huì)。該方法還代表了用于酸和堿氨基酸水解反應(yīng)的安全和自動(dòng)化平臺(tái)。

寵物食品表2.png

表2. 干濕寵物食品中氨基酸的回收率——微波輔助與傳統(tǒng)氨基酸水解

寵物食品圖1.png

圖1. 濕寵物食品的氨基酸水解結(jié)果

 

結(jié)論

這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了CEMDiscover 2.0是一種有效的方法,可用于濕寵物食品和干寵物食品的氨基酸水解。總的來(lái)說(shuō),Discover 2.0的結(jié)果在準(zhǔn)確性和精密度方面較優(yōu)于傳統(tǒng)的烘箱水解結(jié)果,主要優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)時(shí)間更短、水解產(chǎn)物更清潔、分析時(shí)間更快。
 
參考文獻(xiàn)
1 Chen, S. T.; Chiou, S. H.; Chu, Y. H.; Wang, K. T. Int. J. Pept. Protein Res. 1987, 30, 572-576.
2 Margolis, S. A.; Jassie, L.; Kingston, H. M. J. Automat. Chem. 1991, 13, 93-95.
AccQ-Tag™, ACQUITY™ UPLC™ , and TargetLynx™ are trademarks of Waters Corporation.

 

 

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